viernes, 16 de abril de 2010

Análisis molecular de la región ITS de Fusarium spp., agente causal de la marchitez vascular de Vasconcellea heilbornii y Solanum quiotense en Ecuador

RESUMEN: Para determinar la relación genética de Fusarium oxysporum f. sp. vasconcellea y Fusarium oxysporum f. sp. quitoense, se evaluaron los marcadores moleculares ITS (Internal Transcribed Spacer) del ADN ribosomal (ADNr) de 17 aislamientos asociados a la marchitez vascular del babaco (Vasconcellea heilbornii) y naranjilla (Solanum quiotense). Los iniciadores universales ITS1/ITS4 mostraron productos de amplificación de 521 a 538 pb. para la región ITS. Esta región mostró ser altamente conservada en todos los aislamientos, excepto el aislamiento AL1 que mostró un porcentaje de divergencia del 7.95 % respecto a los demás aislamientos. Se identificaron sitios de restricción para EcoRI, MboI, HapII, HaeIII, BamIII, TaqI, HindI, HspAI, SphI, AluI, MseI, MaeII, HindII, PstI. El sitio de restricción PstI es específico para el aislamiento AL1. La matriz de similitud mostró el 89 al 100% de similitud entre cepas; además reveló que aislamientos de diferentes regiones geográficas muestran el 100 % de similitud. El mismo análisis mostró que secuencias de cepas de diferentes formas especiales aparecen en un mismo clusters, mientras que cepas pertenecientes a la misma forma especial aparecen en agrupamientos diferentes. En base a la matriz de similitud se elaboraron arboles filogenéticos con los métodos NJ (Neighbor-Joining) y UPGMA (Método promedio aritmético de grupos de pares no ponderados), separando a las cepas en dos y cuatro agrupamientos. Los resultados mostrados identificaron a la cepa AL1 como la especie Fusarium colmorum. El análisis de los perfiles ITS del ADNr mostró ser una poderosa herramienta para establecer la variabilidad genética interespecífica entre hongos fitopatógenos.
Palabras Claves: Fusarium oxysporum, formas especiales, Vasconcellea quitoense, vasconcellea heilbornii, ADNr, MVB, MVN, ITS, diversidad genética.

ABSTRAC: To determine the genetic relation of Fusarium oxysporum f. sp. vasconcellea and Fusarium oxysporum f. sp. quitoense, of 17 isolates associated with vascular wilt of Babaco (Vasconcellea heilbornii) and naranjilla (Solanum quiotense), molecular markers (Internal Transcribed Spacer-ITS) of rDNA. The universal primers (ITS1/ITS4) showed amplification products of 521 to 538 bp for the ITS region. This region was highly conserved in all isolates, except in the AL1isolation with a rate of 7.95 % of divergence. EcoRI, MboI, HapII, HaeIII, BamIII, TaqI, HindI, HspAI, SphI, AluI, MseI, MaeII, HindII, PstI were identified. The PstI restriction site is specific for AL1 isolation. The similarity matrix showed 89 to 100 % between strains, and strain from different geographical regions are 100 % similar. The sequences of strain with different special forms appear in the same clusters, while sequences belonging to the same special form appear in different clusters. Phylogenetic analysis through NJ (Neighbor-Joining) and UPGMA (unweighted pair group method average arithmetic) were used. The AL1strein was identified as Fusarium colmorum. The analysis of ITS in rDNA shows to be the most efficient tool to establish interspecific genetic relation among fungal pathogens.

Key words: Fusarium oxysporum, special forms, Vasconcellea quitoense, Vasconcellea heilbornii, rDNA, MVB, MVN, ITS, genetic diversity.

INTRODUCCIÓN
El babaco (Vasconcellea heilbornii) (Heilbornii) (Badillo, 1993) es un hibrido estéril, originario de los valles interandinos y la naranjilla (Solanum quitoense) (Lamarck) (Heiser et al. 1999) de los bosques húmedos de la región sub-tropical oriental y occidental de la cordillera de los Andes de Ecuador y Colombia. Los cultivos de babaco producen alrededor de 200 Ton/Ha y la naranjilla 30 Ton/Ha (Meneses & Correa, 1992), constituyéndose en uno de los principales rubros de subsistencia, para miles de familias ecuatorianas. Sin embargo la producción de babaco y naranjilla está limitada principalmente por la presencia de plagas y enfermedades, que tienen una repercusión económica importante en su rendimiento.
Entre los patógenos que causan mayores pérdidas económicas, se encuentran Fusarium oxysporum f. sp. vasconcellea (Ochoa et al. 2004) y Fusarium oxysporum f. sp. quitoense (Ochoa et al. 2004), que producen la marchitez vascular del babaco (MVB) y de la naranjilla (MVN), tanto en campo como a nivel de invernadero, llegando a distribuirse en todo el País, ocasionando pérdidas del 80 % en naranjilla y hasta el 100 % en cultivos de babaco (Ochoa et al. 2004).

Fusarium oxysporum infecta estos cultivos en todas las edades y no es posible detectar su presencia en su estado inicial; por lo general, los primeros síntomas aparecen al mes de la infección (Ochoa et al. 2004), los cuales dependen de la humedad, temperatura y suelos con textura arenosa. Entre los síntomas, se puede observar clorosis de hojas seguido de un marchitamiento y finalmente la muerte de la planta (Ochoa et al. 2004).
F. oxysporum es una de las especies que presenta un alto nivel de variabilidad genética, por la influencia de mutaciones, recombinación genética, flujo de genes, selección y las condiciones ambientales (Armstrong & Armstrong, 1981), esta variabilidad genética le ha permitido evolucionar rápidamente y adaptarse a nuevos hospederos y fungicidas; actualmente se conoce aproximadamente 120 formas especiales (f sp) (Agrios, 2001).

Debido a las características de la enfermedad, los métodos de control químico como biológicos, han resultado inconsistentes en el campo y muy costosos para el agricultor; además, contribuyen a la contaminación ambiental y deterioran la biota del suelo (Jiménez-Gasco et al. 2001). De todos los métodos de control, mejores resultados ha producido el desarrollo de cultivares resistentes a Fusarium spp. La resistencia que ha presentado fusarium hacia algunos fungicidas y el uso indiscriminado de estos son elementos suficientes para suponer que la diversidad genética de este hongo es muy amplia. En la actualidad, el diagnóstico de esta enfermedad se realiza mediante pruebas de patogenicidad, lo que implica gran cantidad de tiempo y material, por lo tanto, una alternativa es encontrar nuevos métodos para un diagnostico rápido, consistente y confiable.

En los últimos años, el avance de las técnicas moleculares y principalmente aquellas basadas en la técnica de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), como los Polimorfismos de la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLPs)(Botstein et al. 1980) ADNs Polimorfitos Amplificados al Azar (RAPD) (Williams et al. 1990; Welsh & McClelland, 1990), los Microsatélites o Secuencias Repetidas Simples (SSR) (Jeffryes et al. 1985), Polimorfismos de la Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLPs) (Vos et al. 1995), el estudio molecular de las regiones ITS e IGS (White et al. 1990) y ADN mitocondrial (ADNmt) han permitido el desarrollo de metodologías rápidas, objetivas y aplicables a un gran número de muestras, así como, el diseño de primer específicos, para la detección y caracterización de diversos hongos patógenos de plantas en cultivos de importancia económica, como: Candida, Aspergillus, F. oxysporum f. sp. albedinis, F. oxysporum f.sp. melonis, Fusarium spp, F. oxysporum f. sp. cañariensis (Leung et al. 1993) y bacterias (Henson et al. 1993 y Martin et al. 2000).

Por lo expuesto, el objetivo del estudio, fue determinar la variabilidad genética de F. oxysporum en cultivos de babaco y naranjilla, utilizando iniciadores universales para la amplificación de las region ITS del gen de ADNr, mediante el método de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Obtención y cultivo de cepas de Fusarium sp.
Muestras de tejidos de raíces y tallos de plantas de Vasconcellea heilborni con síntomas de marchitamiento vascular causado por Fusarium sp. fueron colectadas entre los meses de agosto y octubre del 2009 en las provincias de Pichincha, Chimborazo, Tungurahua y Loja. Cada muestra fue esterilizada en solución de etanol al 75 % por un minuto, posteriormente tratado con hipoclorito de sodio al 5 % por un minuto y enjuagado tres veces con agua destilada estéril dentro de la cámara de flujo laminar. Las muestras axénicas fueron transferidas a platos Petri de 90 mm por 15 mm con 20 ml de medio agar papa dextrosa (PDA) y selladas con cinta parafilm e incubados a 25 0C por 7 días (Riveros et al. 2001).
Tabla 1. Origen de los aislamientos de Fusarium spp utilizados en el análisis de la región ITS.
Cepa Especie Origen Cultivo Lugar
PU1 Fusarium sp. IASA Babaco Puembo
LE2 Fusarium sp. IASA Babaco Leito
IA3 Fusarium sp. IASA Babaco Iasa-1
PA4 Fusarium sp. IASA Babaco Patate
LO5 Fusarium sp. IASA Babaco Loja
CH6 Fusarium sp. IASA Babaco Chambo
NA1 Fusarium sp. INIAP Naranjilla Baeza
NA2 Fusarium sp. INIAP Naranjilla Sucúa
NA3 Fusarium sp. INIAP Naranjilla San Francisco
NA4 Fusarium sp. INIAP Naranjilla Río Negro
NA5 Fusarium sp. INIAP Naranjilla Tandapi
NA6 Fusarium sp. INIAP Naranjilla Nanegalito
LC1 Fusarium sp. IASA Clavel Puembo
GL1 Fusarium sp. IASA Gladiolo Tababela
TR1 Fusarium sp. IASA Tomate Puembo
Al1
PY1 Fusarium sp.
Fusarium sp. IASA
IASA Alcachofa
Papaya Chambo
Sto. Domingo
Los aislamientos de Fusarium sp de tejidos de plantas de Solanum quitoense fueron facilitados por el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Experimental Santa Catalina (INIAP). Los aislamientos adicionales de Fusarium sp de plantas de papaya, gladiolo, clavel, alcachofa, tomate riñón, fueron facilitados por el Laboratorio de Fitopatología de la Carrera de Ciencias Agropecuarias de la Escuela Politécnica del Ejército (Tabla 1). De cada una de las cepas se obtuvieron cultivos monospóricos, y se conservaron mediante resiembras periódicas en platos petri con medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA), que posteriormente fueron utilizados en las pruebas de patogenicidad y reacciones de PCR. El cultivo de las cepas se realizó en los Laboratorios de Fitopatología de la Carrera de Ciencias Agropecuarias de la Escuela Politécnica del Ejército y conservados a 4 °C en medio de cultivo hasta su utilización.
2.3. Extracción del ADN genómico
La extracción del ADN genómico se realizó con el método propuesto por Kim et al. (1992) con ligeras modificaciones realizadas por el autor. El método consistió en moler directamente 500 mg. de micelio de 7 días de crecimiento en un tubo Eppendorf de 1.5 ml con 500 ml de buffer CTAB (200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 250 mM de NaCl; 1% SDS; 1% β-mercaptoetanol, 2% CTAB), se añadió 1.5 µl de proteinasa K por muestra (0.1 mg/ml) e incubado a 65 0C por una hora. Luego se añadió 700 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) y centrifugado a 13000 rpm por 30 minutos (dos veces). Al sobrenadante se le trató con 1 µl de RNAsa (50 µg/ml) e incubado por 1 hora a 37 0C. Posteriormente se añadió 1 volumen de Cloroformo-alcohol isoamilico (24:1) y centrifugado a 13000 rpm por 15 minutos. El ADN se precipito con 25 µl de acetato de sodio 3M (pH 5.2) y 500 µl de isopropanol frío e incubado por 24 horas a -20 0C, posteriormente se centrifugó a 13,000 rpm por 15 minutos. EL pellet fue lavado con 400 µl de etanol 75 % y centrifugado a 13000 rpm por 10 minutos. La muestra de ADN fue secada al ambiente por 15 minutos y se resuspendido en 50 µl de TE (Tris-HCl 10 mM y 1mM EDTA, pH 8.0) y conservado a -20 0C.

2.4. Amplificación mediante la PCR
Los iniciadores universales ITS-fu-f 5´-AACTCCCAAACCCCTGTGA-3´ y ITS-fu-r 5´-GCGACGATTACCAGTAACGA-3´ fueron utilizados para la identificación del género Fusarium y los iniciadores ITS1 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´ y ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ para la amplificación de la región ITS del ADNr ribosomal (Fig. 1). Las reacciones de PCR se realizaron en50 µl con 40 ng de ADN genómico, 2.5 U de GoTaq polimerasa (10 µl de Buffer 5X, 3 mM de MgCl2,), 20 pmol de cada primer, 200 mM de dNTPs. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador Biometra (Germany) con el siguiente programa: un paso previo de desnaturalización inicial de 94 0C por 5 minutos, 35 ciclos a 94 0C por 1 minuto; 58 0C por 30 segundos; 72 0C por 1 minuto, seguida de una extensión final 72 0C por 7 minutos. En cada amplificación se incluyó un control negativo con agua destilada estéril en lugar de ADN, con el objetivo de descartar cualquier contaminante que pudiera interferir en los resultados. La integridad del ADN fue comprobada en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio (EtBr) al 1% en tampón TAE 1X y visualizados en un transluminador bajo luz ultravioleta (UV).

Figura 1. Región ITS del ADNr ribosomal, en la que se muestra la ubicación de los primers ITS1 e ITS4

2.5. Análisis de datos
Los productos amplificados por PCR con los iniciadores universales ITS-fu-f/ ITS-fu-r y ITS1-ITS4 fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5 % en tampón TAE 1X (Trisacetato 40 mM y EDTA 1,0 mM) y teñidos con bromuro de etidio al 1% (1 μg/ml), luego visualizados en un transluminador bajo luz ultravioleta (UV), luego documentados para su análisis. Los productos de la PCR fueron secuenciados en ambas direcciones por la empresa MACROGEN (Seúl-Corea). La comparación de secuencias se realizó con el programa BLAST de la base de datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Korf et al. 2003) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El alineamiento de secuencias se realizó con ClustalW 2.0 del EMBL (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) (European Biology molecular) (Tompson et al. 1997). Las matrices de similitud se realizó con el programa SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html). Los sitios de restricción se identificaron con el programa Webcutter 2.0 de la EMBL (European Biology Molecular) (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/). Los árboles filogenéticos con los métodos NJ (Neighbor-Joining) y UPGMA (Método promedio aritmético de grupos de pares no ponderados) se elaboró con el programa Mega Software 4.1 (http://www.megasoftware.net/mega41.html) (Tamura et al. 2007).

3. RESULTADOS

3.1. Determinación del género Fusarium sp.

Los iniciadores ITS-fu-f/ITS-fu-r, generaron productos de amplificación de aproximadamente 400 pares de bases, el tamaño de los productos fue determinado en base al tamaño del marcador de peso molecular (100 bp DNA ladder, Promega). No se obtuvo productos de amplificación con el aislamiento PY-1, por lo que fue necesario realizar una limpieza adicional del ADN con isopropanol, para eliminar residuos de cloroformo que podrían inhibir la reacción de PCR. Posiblemente el aislamiento PY-1 posee inhibidores para PCR que no pueden ser removidos con los protocolos utilizados para la extracción de ADN, corroborando los resultados obtenidos por Kamel et al. (2003), quien manifiesta que los primers ITS-fu-f y ITS-fu-r no son específicos para todas las especies del género Fusarium.













Figura2. Gel de agarosa con los productos de amplificación de la región ITS con los primers ITS1 y ITS4: M marcador peso molecular, línea 1, PU-1, 2 TU-2, 3 IA-3, 4 PA-4, 5 LO-5; 6 CH-6, M marcador peso molecular, 7 Na-1, 8 NA-2, 9 NA-3, 10 NA-4; 11 NA-5, 12 NA-6, C- control negativo, 13 GL-1, 14 LC-1, 15 TR-1, 16 AL-1y 17 PY-1, C- control negativo, M marcador de peso molecular.
3.2. Amplificación de la región ITS

Los iniciadores ITS1/ITS4 generaron productos de amplificación de 521 a 538 pb (Fig.2), inclusive con el aislamientos PY-1, el tamaño de los fragmentos se determinó en base al tamaño del marcador de peso molecular (100 bp DNA ladder, Promega) y la secuenciación de las cadenas en ambas direcciones. Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los reportados por Kamel et al. (2003), en otras formas especiales; al igual que los obtenidos por Abd-Elsalam et al. (2003) en Fusarium oxysporum f sp vasinfectum; Fusarium moniliforme y Fusarium solani, cuyas regiones ITS varían entre 550 y 570 bp. Igualmente Calle (2005) en México reportó el tamaño de la región ITS de 535 pb para Fusarium equiseti. Pattanamahakul & Strange (1999) obtuvieron resultados similares en otros géneros y especies de hongos fitopatógenos como Alternaria brassicicola.
3.3. Comparación de secuencias Homologas ITS con la base de datos del Genbank

Los fragmentos ITS secuenciados fueron analizados con el programa BLAST de la base de datos del banco de genes de la NCBI, las cuales mostraron una homología del 98 al 100%, encontrándose pequeñas diferencias en la secuencia nucleótidos con otras formas especiales de F. oxysporum y Gibberella zeae presentes en el banco de genes (Tabla 2). El aislamiento AL1 comparado con las secuencias ITS de Gibberella zeae (accesión Genbank AB289549.1) y Fusarium colmorum (accesión Genbank AY147334.2) mostraron una homología del 100% (Tabla 2).
Tabla 2. Comparación de secuencias homólogas ITS de Fusarium spp con la base de datos del Genbank
Cepa Organismo Numero Acceso Máx
Score Query
coverage Máximo %
identidad

PU1 Fusarium oxysporum AB369259.1 859 100 % (465/465) 100%
LE2 Fusarium oxysporum AB369259.1 857 100 % (464/464) 100%
IA3 Fusarium oxysporum AB369259.1 852 100 % (463/464) 99%
PA4 Fusarium oxysporum AB369259.1 854 100 % (464/465) 99%
LO5 Fusarium oxysporum AB369259.1 854 100 % (464/465) 99%
CH6 Fusarium oxysporum AB369259.1 854 100 % (464/465) 99%
NA1 Fusarium oxysporum EU091024.1 859 100% (465/465) 100%
NA2 Fusarium oxysporum AY147369.1 841 100% (462/465) 99%
NA3 Fusarium oxysporum AB369259.1 481 100% (260/260) 100%
NA4 Fusarium oxysporum AB369482.1 859 1005 (465/465) 100%
NA5 Fusarium oxysporum AY147369.1 859 100% (465/465) 100%
NA6 Fusarium oxysporum AB369482.1 854 100% (464/465) 99%
LC1 Fusarium oxysporum X94173.1 859 100% (465/465) 100%
GL1 Fusarium oxysporum AY147369.1 859 100% (465/465) 100%
TR1 Fusarium oxysporum AB369482.1 859 100% (465/465) 100%
Al1 Gibberella zeae
Fusarium culmorum AB289549.1
AY147334.2 861
1022 100%
100% (466/466) 100%
(466/466) 100%

3.4. Alineamiento de secuencias

El alineamiento de la secuencias mostró que la región ITS1 tiene un tamaño de 113 pb en todos los aislamientos; el gen 5.8S con 141 pb; la región ITS2 con 168 pb y la secuencia parcial del gen 28S con 42 pb. La región ITS1 y ITS2 mostraron pequeñas diferencias de nucleótidos en los aislamientos PU1, LE2, NA2, NA4, NA6, TR1 y AL1 (datos no mostrados), al respecto González et al. (1990) manifiestan que la longitud de las secuencias ITS1 e ITS2 varía desde más de 1000 pb en las células humanas hasta menos de 300 pb en algunas levaduras. Estas regiones han sido utilizadas en numerosos estudios como diana para la identificación de especies fúngicas (Iwen et al. 2002).

En base a las secuencias ITS se construyó la matriz de similitud, la que mostró una identidad del 96% al 100% con Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (accesión Genbank EU849584.1), excepto la cepa AL1 que mostró un porcentaje de similitud del 89 al 92%. Las cepas de cultivos de babaco mostraron el 97 al 100% de similitud y entre cepas de cultivos de naranjilla del 98 al 99%. Además el mismo análisis reveló que aislamientos de diferentes regiones geográficas muestran el 100 % de similitud. Igualmente secuencias de diferentes formas especiales mostraron el 96 al 98 % de similitud (Tabla 3).
Tabla 3. Matriz de similitud de las secuencias ITS de Fusarium sp. de Babaco, Naranjilla y otros cultivos









3.4. Alineamiento de secuencias ITS e identificación de sitios de restricción




Se identificaron 15 sitios de restricción en las secuencias ITS. En la región ITS1, tres sitios de restricción MboI, HapII, HaeIII; con la enzima HapII todos los aislamientos mostraron un corte en el nucleótido 32, excepto los aislamientos NA2 y AL1; en el gene 5.8S se identificaron siete sitios de restricción para todos los aislamientos para MboI, BamIII, TaqI, EcoRI, HindI, HspAI y SphI. En la región ITS2 se identificaron ocho sitios de restricción para TaqI, AluI, HinfI, MseI, MaeII, HindII, HaeIII, MseI; la enzima HinfI realiza un corte en el nucleótido 301 en todos los aislamientos excepto el aislamiento AL1, en esta región se localizó un sitio de restricción para PstI que realiza un corte en el nucleótido 304 específico para el aislamiento AL1; los resultados fueron comparados con otras secuencias de la región ITS2 presentes en el GenBank, confirmándose que el sitio de restricción para PstI (CTgCAg) ubicado entre los nucleótidos 306 y 312 permite diferenciar entre especies del género Fusarium spp. (datos no mostrados).
3.5. Análisis filogenético de la región ITS

El análisis mediante el método UPGMA (Método promedio aritmético de grupos de pares no ponderados) (Sneath & Sokal, 1973). Separó a los aislamientos en cuatro clusters (Fig. 3): el primer grupo con dos subdivisiones se encuentran los aislamientos cuyas secuencias son altamente conservadas PA4, IA3, LO5, CH6, NA1, NA3, NA5, GL1, LC1, PU1, LE2, NA4, TR1; en el segundo y tercer grupo se ubican los aislamientos NA6 y NA2 respectivamente y en el cuarto grupo se encuentra el aislamiento AL1.
El árbol filogenético Neighbor-Joining, ubica los 16 aislamientos en dos clusters (Fig. 4). En el primer grupo se ubican los aislamientos PU1, LE2, PA4, IA3, LO5, CH6, NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, GL1, LC1, TR1, NA6, en el segundo grupo se encuentra el aislamiento AL1 obtenido de cultivo de alcachofa.
















Figura 3. Árbol filogenético de las secuencias ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr, de Fusarium sp mediante el método UPGMA. Secuencias PU1, LE2, IA3, PA4, LO5, CH6 (cultivos de babaco), NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6 (cultivos de naranjilla), GL1 (cultivos de gladiolo), LC1 (cultivos de clavel), TR1 (cultivos de tomate riñón), AL1 (cultivos de alcachofa). Los aislamientos Fusarium sp. (FJ715505.1), Gibberella sp. (FJ466715.1), Gibberella zeae (DQ459832.1) fueron utilizadas para mostrar la homología de secuencias.
4. DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en este estudio reafirman aquellos mostrados por otros autores en el sentido que las secuencias ITS es una herramienta molecular que permite la identificación de géneros y especies de Fusarium spp. El alineamiento de secuencias, matrices de similitud y análisis filogenético de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) han mostrado que los 16 aislamientos analizados pertenecen al género Fusarium, de los cuales 15 pertenecen a la especie oxysporum, excepto el aislamiento AL1 que mostró una diferencia de 38 pb en relación al organismo de referencia, con un porcentaje de divergencia de 7.95 %. Estos resultados corroboran a los reportes realizados por Scrotch et al. (1996) citado por Aguilar, (2002) quienes aseguran que valores superiores al 5 % de disimilaridad, son suficientes para considerar como especies diferentes. Esto nos permite aseverar que el aislamiento AL1 corresponde a la especie Fusarium colmorum.

En cultivos de babaco, los aislamientos IA3, LO5, PA4 y CH6 se diferencian de los aislamientos PU1 y LE2 en un nucleótido. En cultivos de naranjilla, los aislamientos NA1, NA3 y NA5 se diferencian de los aislamientos NA2, NA4, NA6 en uno y dos pares de bases (pb). La matriz de similitud y el análisis filogenético mostraron secuencias altamente conservadas en la región ITS y mostraron poca variabilidad genética entre a pesar de haber sido colectados en diferentes regiones geográficas. La cepa AL1 mostró 89% de similitud, mientras la cepa CH6 mostro el 100% de similitud con el organismo de referencia F. oxysporum f. sp vasinfectum, Las secuencias ITS de cultivos de babaco mostraron del 97 al 100% de similitud y entre cultivos de naranjilla el 98 al 99% de similitud.


Figura 4. Árbol filogenético de las secuencias ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr de Fusarium spp. Con el método Neighbor-Joining. El orden de las secuencias PU1, LE2, IA3, PA4, LO5, CH6 (cultivos de babaco), NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6 (cultivos de naranjilla), GL1 (cultivos de gladiolo), LC1 (cultivos de clavel), TR1 (cultivos de tomate riñón), AL1 (cultivos de alcachofa). Los aislamientos Fusarium sp (Accesión GenBank FJ715505.1), Gibberella sp. (Accesión GenBank FJ466715.1), Gibberella zeae (Accesión GenBank DQ459832.1) fueron utilizadas para mostrar la homología de secuencias. Las Secuencias outgroup pertenecen a Trichoderma sp. (Accesión GenBank AM944350.2) y Bispora sp. (Accesión GenBank EU927406.1)
El análisis filogenético de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) analizado con el método UPGMA reafirman los resultados mostrados en la matriz de similitud, la misma que divide a los 16 aislamientos en 4 agrupaciones; en el primer grupo con dos subgrupos. En el primer subgrupo se ubican los aislamientos con regiones altamente conservadas; en el segundo subgrupo se ubican a los aislamientos que difieren en un pb; en el segundo y tercer grupo se ubican las cepas con 2 pb y en el último grupo la cepa AL1 con 36 y 37 pares de bases de diferencia.

El análisis filogenético mediante el método Neighbor-Joining (vecino más cercano) divide a los 16 cepas en dos grupos; en el primer grupo se ubican 15 aislamientos y en forma muy divergente se encuentra el aislamiento AL1, confirmándose los resultados mostrados en la matriz de similitud. Los resultados presentados en este trabajo son diferentes a los resultados reportados por (Nazar et al. 1991; Moukhamedov et al. 1994; Schilling et al. 1996; Moricca et al. 1998; O`Donnell (1992) quienes encontraron divergencia de nucleótidos en región ITS en cepas de F. sambucinum, usando primers ITS1/ITS4.

Los resultados mostrados son similares a los reportados por O´Donnel et al. (1998), quienes demostraron que varias formas especiales de F. oxysporum no tienen un origen nonofiletico y que organismos de una forma especial están estrechamente relacionados con organismos pertenecientes a otras formas especiales de F. oxysporum, al parecer las formas especializadas de F. oxysporum forman parte de un grupo polifilético (Baayen et al. 2000). El mismo O’Donnell et al. (1998) afirma que algunas formas especializadas del complejo F. oxysporum son polifiléticos, esto implica que cepas con una base genética muy diferente han adquirido genes patógenos, aparte de la posible existencia de múltiples mutaciones y eventos de transposición que podrían haber conducido a la adquisición independiente de patogenicidad al mismo hospedero.

Finalmente podemos manifestar que F. oxysporum carece de un estado sexual conocido y la ocurrencia de recombinación parasexual en condiciones naturales no ha sido documentada y puede ser poco probable. Por tanto, la mutación parece ser la principal fuente de variación que proporciona y mantiene la variabilidad genética en este organismo. Para explicar gran parte de la variabilidad genética observada en F. oxysporum se ha postulado la actividad de transposones (Daboussi & Langin, 1994; Daboussi et al. 1992). Los transposones pueden constituir hasta el 5% del genoma de F. oxysporum, y por tanto pueden tener un gran impacto en la estructura y función de algunos genes, así como en la organización cromosómica.
5. CONCLUSIONES

• Los resultados mostrados en esta investigación, utilizando los marcadores de ADNr ribosomal de la región ITS nos permite aseverar que más de una técnica molecular puede ser utilizada para inferir la variación genética interespecífica entre formas especiales de F. oxysporum f. sp. vasconcellea y F. oxysporum f. sp. quitoense, agentes causales de la marchitez vascular de babaco (MVB) y naranjilla (MVN).

• Los iniciadores ITS-fu-f y ITS-fu-r determinaron que los aislamientos utilizados en esta investigación corresponden al género Fusarium spp., de acuerdo al marcador de peso molecular los productos de amplificación fueron de 400 pb.

• Los iniciadores universales ITS1/ITS4 generaron productos de amplificación de 521 a 538 pb y mostró ser altamente conservada con poca variabilidad genética en todos los aislamientos analizados, excepto el aislamiento AL1 que mostró ser totalmente divergencia con el 7.95 % en relación a la secuencia de referencia F. oxysporum f. sp. vasinfectum.

• Scrotch et al. (1996) citado por Aguilar, (2002) aseguran que valores superiores al 5 % de disimilaridad, son suficientes para considerar como especies diferentes. Esto nos permite aseverar que el aislamiento AL1 corresponde a la especie Fusarium colmorum.
6. RECOMENDACIONES

• A pesar que los marcadores moleculares utilizados en esta investigación son de gran aceptación por varios investigadores y los resultados mostrados ubican a los aislamientos dentro de la especie de Fusarium oxysporum, es necesario aplicar otros marcadores moleculares (AFLPs, SSR, RFLPs, Caja HMG, Factor de elongación), para identificación rápida y oportuna, así, como el análisis de una mayor cantidad de muestras, a fin de determinar la variabilidad genética intraespecífica de F. oxysporum como agente causal de la marchitez vascular del babaco y la naranjilla.
7. AGRADECIMIENTO
A la Carrera de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias “Santo Domingo” de la Escuela Politécnica del Ejército por su apoyo para el desarrollo de este estudio. Al Sr. Ing. José Ochoa, técnico del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), por facilitar las cepas de Fusarium oxysporum f. sp. quitoense; al Sr. Ing. Abraham Oleas, Fitopatólogo de la Carrera de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias, por facilitar las instalaciones para el aislamiento y cultivo de las cepas de Fusarium oxysporum.
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